Engineering of viral surfaces and production methods for gene therapy applications
Tid: Fr 2026-09-25 kl 09.30
Plats: Kollegiesalen, Brinellvägen 8, Stockholm
Språk: Engelska
Ämnesområde: Bioteknologi
Respondent: Hannes Thorell , Proteinteknologi
Opponent: Doktor Bernard Schneider, École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)
Handledare: Professor Johan Rockberg, Proteinteknologi; Docent Magdalena Malm, Proteinteknologi; Universitetslektor Greta Hultqvist, Dept. of Pharmacy, Uppsala University, Uppsala, Sweden
QC 2026-08-21
Abstract
Flera genetiska sjukdomar kan nu lindras med genterapier. Adeno-associerade virus (AAV) används i hög grad i dessa terapier, där AAV-genomet bytts ut mot en terapeutisk gen. AAV-terapier är dock väldigt dyra eftersom AAVer är svåra att producera rekombinant. Därtill är AAVer inte organspecifika, vilket ökar dosen som krävs för att få effekt. Priset drivs då upp samt risken för biverkningar, där levern är särskilt utsatt. Denna avhandling redogör för metoder för att förbättra AAV-produktionen och för att skapa organspecifika AAVer.
AAV-produktion kräver mycket plasmid-DNA och i utvecklingsfasen av AAV-terapier sker plasmidrening oftast manuellt. I avhandlingens första artikel jämförs automatisk plasmidrening med ett manuellt reningskit (industristandarden). Det automatiserade systemet minskade aktivt arbete med upp till 95 %, därtill med likvärdiga eller upp till 14 gånger högre AAV-titrar beroende på AAV-produktionssystem. Olika transfektionsparametrar studerades sedan, där vi såg att automatiskt renade plasmider ger större transfektionskomplex.
De nästkommande två artiklarna beskriver avhandlingens huvudarbete: utvecklingen av en modulär plattform för organspecifika AAVer. Genom att fästa affinitetsproteiner kallade Affibody-molekyler på virusen blev AAVerna infektiösa endast mot celler vars yta uppvisar den receptor som Affibody-molekylen har affinitet mot. Affibody-AAVerna uppvisade selektivt cellupptag in vitro samt förändrat organupptag in vivo, med kraftigt minskat upptag i levern. Kryo-elektronmikroskopi (Kryo-EM) av Affibody-AAV-viruset gav en högupplöst proteinstruktur vid 1.67 Å. Därtill presenteras strukturdata som visar hur Affibody-molekylen sitter på ytan av ett AAV.
Den sista artikeln jämför AAV-produktion mellan två vanliga AAV-produktionscellinjer: ytvidhäftande HEK293T och suspensionsväxande HEK293F. HEK293T tillverkade AAVer i högre titrar (3 till 633 gånger högre) än HEK293F, och virus utsöndrades upp till 316 gånger mer från HEK293T. Genom att skapa AAV-hybrider ökades utsöndringen. Studier i celluttryck av heparansulfatproteoglykaner (HSPG), som AAV-varianten AAV2 binder, visa att lägre HSPG-nivåer på HEK293F kan potentiellt öka AAV2-utsöndringen.
Sammanfattningsvis bidrar forskningen i denna avhandling till att skapa mer effektiva AAV-terapier samt till idéer för att förbättra AAV-produktionen. Därtill kan den presenterade Affibody-AAV-plattformen användas för att skapa nya genterapier för organ som naturligt förekommande AAVer inte infekterar.