Till innehåll på sidan

Sample-to-answer paper-basednucleic acid amplification tests

Tid: Fr 2022-11-25 kl 14.00

Plats: Kollegiesalen, Brinellvägen 8, Stockholm

Språk: Engelska

Ämnesområde: Fiber- och polymervetenskap

Respondent: Georgios Chondrogiannis , Fiberteknologi, KTH Royal Institute of Technology

Opponent: Associate Professor Keith Pardee, University of Toronto

Handledare: Universitetslektor Mahiar Hamedi, Fiberteknologi; Doktor Jeff Mold,

Exportera till kalender

QC 2022-11-03

Abstract

DNA tester också kallade NAAT tester, utförs idag med PCR-teknik, som först detekterar en specifik DNA och sedan replikerar den för detektion av infektionssjukdomar. PCR tester kräver dock instrument och utbildade personal. Av denna anledning var vi alla tvungna att skicka PCR-test till centraliserade laboratorier under COVID-19-pandemin. Ett år in i pandemin blev antigen pappersbaserade tester tillgängliga för hemtestning, men dessa var fortfarande inte tillräckligt känsliga och PCR-testerna behövde fortfarande användas. Denna utveckling visade behovet av att tillgängliggöra NAAT för hemmabruk. Det har på senare tid gjorts tre tekniska framsteg som för oss närmare sådana tester:_1) Pappersbaserade tester, så kallade pappers mikrofluidik, har utvecklats, för att möjliggöra mer avancerade tester. Dessa pappersbaserade system innehåller avancerad funktionalitet och flera reaktionssteg. 2) Nya DNA-amplifieringstekniker som kallas isotermisk amplifiering har utvecklats. Dessa kan i motsats till PCR köras utan maskiner, under konstant temperatur, och därmed blir DNA-amplifiering möjlig att utföra även inuti ett papper. 3) Flera metoder för att detektera DNA-metoder har visats med papper.

Ett steg som fortfarande inte är helt löst är provberedningssteget för NAAT. I provberedningen extraheras nukleinsyror från bakterier eller virus, vanligtvis genom användning av reagenser som är förstörr DNA-amplifiering. Provbredning är därför komplicerade. Dom kräver flera tvättsteg och uppvärmning och är därför svåra att integrera i papper.

I det här arbetet använde vi en enkel, kostnadseffektiv och skalbar metod för att integrera provberedning i papper. Våra resultat tar oss ett steg närmare DNA självtestning. Vi löser problemet med provbredning genom att immobilisera relevanta enzymer på nitrocellulosapapper. Dessa immobiliserade enzymer förblir funktionella och kan sedan utföra biokemiska reaktioner, samtidigt som de är starkt bundna till papperet. Denna metod möjliggör separation av provbredningssenzymer från, andra känsliga reaktioner såsom DNA-amplifiering. Samtidigt elimineras behovet av högtemperaturdeaktivering eller tvättsteg. Vi visar specifikt att enzymet akromopeptidas kan ta sönder cellväggen för att extrahera DNA hos Staphylococcus-epidermidis bakterien, en vanlig patogen, och vi kan sedan direkt använda bakteriens DNA i ytterligare reaktion för att utföra en prov-till-svar pappersbaserad DNA test. Dessa tester använder lågtemperatur för amplifieringssteget med en teknik som kallas Recombinase Polymerase Amplification (RPA) och vi utför DNA-detektion med en paperbaserad flödesremsa.

Vi visar vidare att enzymet proteinas K också kan immobiliseras på papper för att sedan förstora RNas:er, ett enzym som bryter ner RNA och som finns i humana salivprover. Möjligheten att använda papper för att ta bort RNAs från saliv öppnar vägen mot självtestning av salivvirus-DNA, som influenza virus.

Slutligen, utvecklade vi ett pappersmikrofluidik system som kunde utföra en enzymkopplad oligonukleotid test. Denna test visar mycket högre känslighet för detektering av amplifierat DNA än vad en kommersiell paperbaserad flödesremsa visar. 

Sammanfattningsvis har denna avhandlig visat några olika lösningar som för oss närmare prisvärda och instrumentfria pappersbaserade DNA tester för hemanvändning.

urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:kth:diva-320961