Automating STED microscopy for functional and structural live-cell imaging

Abstract

Ljusmikroskopi är idag ovärdeligt för forskare inom livsvetenskap för att visualisera och studera biologiska system, vävnader, celler, och beståndsdelar av celler på längdskalor från millimeter ner till nanometer. Uppfinnandet av nanoskopi och dess utveckling de senaste decennenierna har möjliggjort för fluorescensmikroskopi att nå den undre gränsen som tidigare var inom räckhåll endast med elektonmikroskopi. Anledningen till detta är diffraktionsgränsen som dikterar hur väl man kan fokusera elektromagnetisk strålning, och som i praktiken inte tillåter fokusering av synligt ljus till områden mindre än 200 nm i diameter. Nanoskopins överlägsna upplösning kommer däremot inte gratis, utan komplicerad förberedning av prover, förlängda inspelningstider, högre belysningsintensiteter, och begränsade synfält är några av de extra svårigheter som man måste ta hänsyn till. Stimulated emission depletion (STED) mikroskopi är en av dessa metoder som kan avbilda prover från biologiska system med nanometerupplösning, men med alla svårigheter som nämnts ovan. Men med rätt prov så kan metoden leverera en upplösning under 10 nm, och med rätt hänsyn tagen till cellöverlevnad så kan levande celler avbildas. 

I denna avhandling presenterar jag utvecklingen av ett STED-mikroskop med en rad tekniska framsteg som fokuserar på att underlätta användningen av STED-mikroskopi i livsvetenskap och optimera utvinningen av information från bilderna. Utvecklingen har fokuserat på automatisering, med möjligheten att samla in bilddata med både högre genomströmning och i samband med snabba processer i de biologiska systemen, men också förbättrad bildanalys både i form av högre genomströmning och precision samt i samband med datainsamlingen. Jag har också utvecklat kontrollmjukvara med nya strategier för att tillåta fortsatt utveckling och implementering av nya datainsamlingssätt för liknande mikroskop. Dessutom har jag utnyttjat nya fluorescenta molekyler för att förbättra möjligheten att använda tekniken i levande celler och med fler inspelningskanaler samt tillåta fler tillämpningssområden. Slutligen har jag utvecklat ett nytt koncept som tar hjälp av STED, och tillämpat mikroskopet och bildanalys på diverse biologiska system såsom däggdjursceller, vävnader och bakterier. Sammantaget siktar mitt arbete på att presentera nya verktyg för en redan etablerad mikroskopiteknik, för att bidra till fortsatt utveckling, underlätta nya typer av experiment och utöka bredden av tillämpningsområden. 

urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:kth:diva-305055