Bioconjugation of antibodies and affinity proteins for the development of novel diagnostic and therapeutic tools

QC 2024-08-14

Abstract

Antikroppar och affinitetsproteiner är viktiga verktyg inom forskning, diagnostik och terapi. Antikroppar har förmågan att binda till en mängd olika proteintarget med stor specificitet och selektivitet, vilket gör att de kan användas för identifiering eller riktad terapi av förödande sjukdomar såsom cancer. Biokonjugering med andra molekyler möjliggör utvidgning av antikroppsfunktionen, vilket förbättrar dess kapacitet bortom igenkänning och bindning. Genom att fästa en cytotoxisk molekyl som ett cytotoxiskt läkemedel eller en radionuklid till antikroppen kan ett cellförstörande reagens levereras direkt till cancercellerna, vilket ger en lokaliserad effekt och skonar friska vävnader. Att välja en lämplig inmärkningsmetod för att producera högkvalitativa antikroppskonjugat är en avgörande faktor för många tillämpningar. Platspecifik inmärkning är ett attraktivt tillvägagångssätt där lasten riktas till en fördefinierad plats på antikroppen, vilket resulterar i homogena och välkarakteriserade konjugat utan att påverka dess tumörantigenbindande egenskaper. Många olika metoder har undersökts; affinitetsbaserade strategier utgör grunden för denna avhandling. Ligander som Z-domänen, som härrör från Protein A, och FcIII-peptiden binder till Fc-domänen på antikroppsstrukturen, en lämplig plats för att leverera en utvald last. 

I denna avhandling utforskar jag affinitetsligand-baserade och glykankonstruerade platspecifika antikroppsinmärkningsmetoder för produktion av antikroppskonjugat för terapeutiska ändamål och som forskningsverktyg. I arbete I-II använder vi platspecifika inmärkningsmetoder baserade på de Fc-bindande liganderna Z och FcIII tillsammans med en glykanmodifieringsmetod för framställning av antikroppskonjugat för radioimmunoterapi (RIT). Våra metoder resulterade i välkarakteriserade konjugat kovalent märkta med en kelator lämplig för radioinmärkning. Radioimmunokonjugaten utvärderades in vivo och visade stor potential för framtida tillämpningar inom RIT. 

I arbete III syftade vi till att förbättra ett tidigare utvecklat PNA-baserat antikroppsadministrationssystem genom att använda olika inmärkningsstrategier för produktion av antikropps-PNA-konjugat. Sådana system har stor potential att öka upptaget av radioaktivitet i tumören och minska exponeringen av friska vävnader för strålning samt förbättra bildkontrasten vid molekylär avbildning. Här visade vi att genom noggrann modifiering av både de primära och sekundära reagensen kan betydande förbättringar uppnås med PNA-baserad leverans av radioaktivitet. 

Förutom deras framgång som terapeutiska och diagnostiska medel är antikroppskonjugat väletablerade reagenser inom grundforskning. När sekvenseringsbaserade singelcellproteinexpressionsanalyser blir allt mer populära blir produktionen av högkvalitativa antikropps-oligonukleotidkonjugat av stor betydelse. I sådana analyser identifieras specifika antikroppsbundna antigen efter amplifiering och sekvensering av deras motsvarande streckkoder. I arbete IV använde vi Z-domänen för att dekorera en antikroppspanel riktad mot viktiga immuncellmarkörer med unika streckkoder. De streckkodade antikropparna användes i DBS-Pro, en multiplex-singelcellproteinanalysmetod med hög genomströmning. I detta projekt tillämpades DBS-Pro för identifiering av större immuncellsubpopulationer i PBMC-prover. iii I arbete V utforskade vi som ett alternativ till RIT möjligheten att använda affinitetsligander baserade på endogena peptider för radionuklidterapi. Den korta peptiden RM26, riktad mot cancerantigenet gastrin-releasing peptide receptor, som vanligtvis överuttrycks i prostatacancer, är en lovande kandidat för avbildning och terapi. Som en kort peptid lider RM26 av snabb blodclearance, vilket är en utmaning för den terapeutiska tillämpningen av sådana ligander. Vårt tillvägagångssätt för att övervinna detta problem och förlänga cirkulationstiden för RM26 är att konjugera den med en albuminbindande domän (ABD) som kan binda till HSA, det mest förekommande proteinet i vårt blod, och därmed uppnå förlängd uppehållstid i blodet. Genom att designa, producera och utvärdera flera ABD-RM26-konjugatvarianter kunde vi undersöka effekten av molekylär sammansättning på biodistributionen och biotillgängligheten av sådana molekyler samt identifiera kandidater med de mest gynnsamma egenskaperna för framtida tillämpningar. 

Sammanfattningsvis använde jag i denna avhandling rekombinant proteinteknik kombinerat med kemisk syntes för att producera unika proteinkonjugat följt av karakterisering in vitro och in vivo för att utvärdera deras funktionella och biofysikaliska egenskaper. Det experimentella arbetet som presenteras i denna avhandling ger en grund för utvecklingen av nya biokonjugat för mångsidiga framtida tillämpningar. 

urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:kth:diva-351396