Identification and characterisation of chitin and cellulose synthases in oomycetes
New tools for biochemical studies and structure determination
Tid: Fr 2021-11-26 kl 10.00
Plats: U61, Brinellvägen 26, KTH campus, via Zoom: https://kth-se.zoom.us/j/63633011184, Stockholm
Språk: Engelska
Ämnesområde: Bioteknologi
Respondent: Stefan Klinter , Glykovetenskap
Opponent: Dr. Mirjam Czjzek, SNRS/ Sorbonne University
Handledare: Professor Vincent Bulone, Glykovetenskap; Docent Lauren S. McKee, Glykovetenskap, Wallenberg Wood Science Center
Abstract
Trots sina morfologiska likheter med ”äkta” svampar, tillhör oomyceterna en separat eukaryotisk utvecklingslinje av filamentösa mikroorganismer som ingår i gruppen stramenopiler. Stramenopiler beskriver ett fylum av protister som även omfattar de nära besläktade brun- och kiselalgerna. Många oomyceter infekterar växter och djur med förödande konsekvenser och stora ekonomiska förluster för land- och vattenbruk globalt. Infektionerna orsakade av oomyceter resulterar även i stora miljöskador på naturliga ekosystem. Trots att cellväggen påverkar organismens viabilitet och morfogenes, är vår kunskap av oomyceternas cellväggsarkitektur och biosyntetiska enzymer begränsad. Med tanke på det hot som patogena oomyceter utgör, kan avsjöjanden av detajlerna kring cellväggens biosyntes och reglering i dessa patogener medföra förbättrade möjligheter för smittskyddet.
Därför ville vi klarlägga rollen av förmodade, membranbundna glycosyltransferas familj 2-enzymer, som antas vara inblandade i biosyntesen av oomyceternas cellväggspolysackarider. Lämpliga genkandidater identifierades och deras genprodukter analyserades, vilket illustreras av den fylogenetiska analysen av kitinsyntas-genfamiljen (artikel I), och identifiering av cellulosasyntasgener i Saprolegnia parasitica (artikel II) och Phytophthora capsici (artikel III). Uttryck av lovande kandidatgener verifierades med hjälp av olika tekniker, bland andra genuttrycksanalys (artikel II och III), påverkan av inhibitorer på hyfernas tillväxt (artikel I och II) och enzymaktivitet i in vitro analyser (artikel II). Enskilda, förmodade kitinsyntaser från olika organismer (opublicerade data) och cellulosasyntaser från S. parasitica (utökad data för artikel II), samt P. capsici cellulosasyntas 1 (artikel III), producerades, delvis i anrikad och även renad form, i speciellt framtagna jäststammar som tillåter en biokemisk karakterisering av de rekombinanta proteinerna i in vitro enzymanalyser. För att främja funktionsstudier och strukturbestämningar av integrala membranproteiner utvecklade vi DirectMX (artikel IV). DirectMX är en metod som möjliggör rekonstitution av målproteiner tillsammans med omgivande lipider från orenade cellmembraner i Salipro nanopartiklar.