Novel microfluidic based sample preparation methods for rapid separation and detection of viable bacteria from blood for sepsis diagnostics
Tid: Fr 2021-12-03 kl 10.00
Plats: Air Fire, Science for Life laboratory, Tomtebodavägen 23A, Solna
Språk: Engelska
Ämnesområde: Bioteknologi
Respondent: Sharath Narayana Iyengar , Nanobioteknologi, Proteinvetenskap, Science for Life Laboratory, SciLifeLab, Nanobiotechnology
Opponent: Prof. Jonas Tegenfeldt, Lund university
Handledare: Prof. Aman Russom, Science for Life Laboratory, SciLifeLab, Nanobioteknologi
QC 2021-11-10
Abstract
Sepsis, eller blodförgiftning, är ett allvarligt medicinskt tillstånd som kännetecknas av en inflammatorisk respons i hela kroppen orsakad av blodomloppsinfektion. Det sista steget av sepsis kan leda till septisk chock, multipel organsvikt med potentiell dödlig utgång. I tidig sepsis är koncentrationen av bakterier i blodomloppet mycket låg, vilket gör provberedningen mycket utmananande. Snabb diagnos av sepsis är avgörande eftersom varje timmes försenad antibiotikaadministration leder till ökad dödlighet. Vanliga bakteriekultur-baserade metoder kräver 24-72 timmar för bakteriebestämning. Nya, DNA och RNA-baserade, diagnostiska metoder kan ge snabbare svar, men är känsliga för kontaminerande mänskligt DNA, som ger falskt positiva svar på grund av bristen på effektiva provberedningsmetoder. Denna doktorsavhandling syftar till att utveckla nya provberedningsmetoder för snabb och effektiv separation och identifiering av bakterier från blodprov för sepsis diagnostik. Utmaningen inom provberedning behandlas här med två olika tillvägagångssätt. I det första tillvägagångssättet användes inmärkningsfri, storleksbaserad, passiv elasto-inertiell mikrofluidik (viskoelastiska flöden) för att studera beteendet hos större partiklar i polyetenoxid (PEO)-lösningar i olika spiralkonstruktioner (artikel I) . Genom att använda kunskapen från papper I, utvecklades en optimerad spiral konstruktion för att på ett effektivt sätt separera bakterier från blod prov. I denna design förblir blodkropparna fokuserade vid ytterväggen längs hela kanalens längd, medan mindre bakterier migrerar mot innerväggen och kan separeras. E.coli kan separeras ur utspädda blodprover med ett enda spiralchip (artikel -II) med en effektivitet av 82 till 90% beroende på utspädning. Det andra tillvägagångssättet (artikel III) använder en selektiv cell-lyseringsmetod där en ny lysis buffert optimerades för att selektivt lysera blodceller på 5 minuter, samtidigt som bakteriell viabilitet upprätthålls. De lyserade blodcellerna filtrerades genom ett filterpapper för att fånga upp levande bakterier. Med hjälp av färgbaserad analys (Berlinerblått) reducerar levande bakterier metaboliskt järn (III)-komplex, och initierar en fotokatalytisk kaskad mot Berlinerblått-bildning på filterpapperet synligt med blotta ögat. Med hjälp av detta tillvägagångssätt var det möjligt att upptäcka bakterier med blotta ögat. Detta tillvägagångssätt optimerades också ytterligare för att utföra antibiotika-succeptibilitetstest för att bestämma minsta bakterie-tillväxthämmande koncentration. Som ett steg mot snabb genomisk analys studerades och optimerades en ny metod kallad Isotakofores-Rolling Circle Amplification för realtids isotermisk DNA amplifiering (Rolling circle amplification), med fokus och detektion av bakteriellt DNA i en rak mikrofluidisk kanal (artikel IV). 8 Sammantaget kommer dessa utvecklade provberedningsmetoder för snabb och effektiv separation och detektion av viktiga patogener i blod med ytterligare information om minsta bakterie-tillväxt-hämmande koncentration att minska tiden för sepsisdiagnostik och underlätta analyser i framtiden.