Structure studies of membrane associated proteins by transmission electron microscopy
Tid: Ti 2021-11-30 kl 10.00
Plats: T4, Hälsovägen 11C, Huddinge Sweden, Stockholm
Språk: Engelska
Ämnesområde: Teknik och hälsa
Respondent: Zuoneng Wang , Strukturell bioteknik, Carsten Mim
Opponent: Associate professor Anna Sundborger Lunna, Uppsala Universitet
Handledare: Universitetslektor Carsten Mim, Strukturell bioteknik, The Royal Institute of Technology
Abstract
Cellmembran måste ändra form under många cellulära processer såsom proteintrafficking, cytokines och membranhomeostas. Den senare överför fettmolekyler, syntetiserade i det endoplasmatiska retikulet, till alla inre membranomslutna rum. Bin/Amfilysin/Rvs (BAR)-proteinerna är perifera membranproteiner (PMP) vilka spelar stor roll i att skulptera membran samt i regleringen av aktindynamik. Kryo-elektronmikroskopi (kryoEM) har utvecklats till ett kraftfullt verktyg för visualisering av proteiner på membrangränssnitt. I det följande beskrivs hur transmissionselektronmikroskopi och andra biofysikaliska metoder använts för att belysa hur BAR proteiner styr processer på membranet. I detta arbete studerades BAR proteinet brobyggande integrator 1 (BIN1) vilket har en etablerad roll i cancer, Alzheimers sjukdom och myopatier i skelettet. För att erhålla information om BIN1’s interaktion med membranet i så membranlika förhållanden som möjligt användes artificiella lipidsystem såsom liposomer och nanorör. För det första, vi har visat att elektrostatiska interaktioner är viktigare för BIN1 vid bindning på membran med låg kurvatur. Vid hög kurvatur drivs bindningen sannolikt av icke-polära interaktioner. Bildningen av invaginationer (eller av tubuler) regleras av konstellationen av negativt laddade lipider i membranets dubbelskikt eller av elektrostatiska aminosyror i BAR-domänen. Därmed reglerar elektrostatiska interaktioner rekryteringen av BIN1 och hur BIN1 flockas på membranet och den därigenom påföljande membrandeformationen. För det andra, vi har klargjort den roll BIN1 har i aktinets dynamik. KryoEM avslöjar att den muskulära BIN1-isoformen inte binder till fria aktinfilament trots att BIN1 kan med-sedimenteras med aktin efter polymerisering af aktin. Detta innebär att BIN1 företrädesvis buntar ihop aktin snarare än dekorerar fria filament. För det tredje, vi utforskade en strategi för att rena ett aggregationsbenäget BAR-protein. Aggregering är en vanlig egenskap hos perifera membranproteiner. En lovande fusionstag för proteinrening har rapporterats vara den så kallade NT*-taggen, nyligen utvecklad från spindeltrådsprotein. Vi visade att NT*-taggen förbättrar lösligheten och minskar aggregeringen IV av BAR proteinet FAM92A1. Aktiviteten hos det renade FAM92A1-NT* verifierades med negativ-färgnings EM. För det fjärde, vi var intresserade av lipidmetabolismens reglering. Enzymet pyruvat karboxylas (PC) är ett nav i generering av lipidprekursorer. Cellbiologiska analyser identifierade ett långt icke-kodande (long noncoding, lnc) RNA vilket reglerar aktiviteten av PC. Vi studerade interaktionen mellan lnc RNA och PC med biofysiska tekniker. Storleksexkluderings-kromatografi bekräftade förekomsten av komplexet lncRNA-PC in vitro.