Bifunctional ADAPTs: Opportunity for serological Half-life extension and Targeted therapy
Tid: To 2023-06-15 kl 09.30
Plats: D3, Lindstedtsvägen 5, Stockholm
Videolänk: https://kth-se.zoom.us/j/67799461063
Språk: Engelska
Ämnesområde: Bioteknologi
Respondent: Andreas Wisniewski , Proteinvetenskap, Proteintechnology
Opponent: Professor Masood Kamali-Moghaddam, Uppsala universitet
Handledare: Professor Sophia Hober, Centrum för Bioprocessteknik, CBioPT, Science for Life Laboratory, SciLifeLab, Albanova VinnExcellence Center for Protein Technology, ProNova, Proteinteknologi
Abstract
Scaffoldproteiner, proteindomäner som är mindre till storleken, växer i popularitet som biologiska läkemedel tack vare deras specificitet och applicerbarhet inom både diagnostik och terapi. Detta, i kombination med deras stabilitet, låga immunogenicitet och låga produktionskostnad gör dem till lovande alternativ till nuvarande marknadsledande antikropparna. Att de är mindre till storleken medför dock en potentiell risk för kortare cirkulationstid i blodomloppet. Som egenskap kan detta ändå vara till fördel i diagnostisk visualisering, men till nackdel för terapeutiska ändamål.
Denna avhandling har kretsat kring att utveckla dessa proteindomäner med målet att öka deras funktionalitet och därför skapades ett nytt kombinatoriskt proteinbibliotek baserat på ADAPT (ABD-derived affinity protein), som härstammar från en bakteriell albuminbindande domän. Från detta bibliotek var det möjligt att generera affinitetsproteiner som innehar förmågan att simultant binda till avsedda målprotein samt till humant serumalbumin (HSA), en egenskap som har visats öka bindarens halveringstid i kroppen. Specifika proteindomäner identifierades genom att utföra selektioner med fagdisplay mot tumörnekrosfaktor alfa (TNFa) och interleukin 17c (IL-17c); proinflammatoriska cytokiner involverade i ett stort antal olika inflammatoriska sjukdomar vilket gör dem intressanta som mål inom terapeutiska tillämpningar. Erhållna selektionskandidater har analyserats genom sekvensering och varianter som ansågs lovande klonades och producerades i Escherichia coli (E. coli), följt av en detaljerad utvärdering av varje kandidats individuella bindning till deras specifika målprotein, karakterisering av deras stabilitet såväl som deras oligomera tillstånd med hjälp av metoderna Surface Plasmon Resonance (SPR), Circular Dichroism (CD) och Size Exclusion Chromatography (SEC). Det var möjligt att generera bindare som uppfyllde samtliga karakteriseringskriterier, och som påvisade simultan bindning till TNFa eller IL-17c i kombination med albumin. Vidare undersöktes varje bindares förmåga att blockera respektive cytokins interaktion med dess specifika receptor in vitro för att utvärdera deras potentiella användbarhet som läkemedel. Dessa nyutvecklade proteinbindare, som uppvisar hög affinitet till sitt målprotein samt bibehåller sin naturliga bindning till HSA, utgör en ny möjlighet att kunna kombinera fördelarna hos mindre proteindomäner med de fördelar som typiskt tillhör större proteiner. Detta möjliggör en behändig och kostnadseffektiv produktion i bakterier vilket gör dem till ideala kandidater för framtida läkemedel.
Vidare har en tidigare utvecklad ADAPT med specifik bindning till målproteinet HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) genetiskt fusionerats med en förbättrad variant av enzymet HRP (horseradish peroxidase). Fusionsproteinet kombinerar målsökande tumörterapi genom ADAPT med användningen av HRP för att enzymatisk katalysera det inaktiva substratet IAA till dess aktiva form som cellgift. Efter att ha demonstrerat att dessa nya fusionsproteiner har liknande bindningskinetik till målproteinet samt jämförbar enzymatisk aktivitet som HRP allena, testades de cytotoxiska effekterna in vitro. Eftersom fusionsproteinerna endast verkade mot HER2-positiva celler påvisades fördelen med en genetisk fusion av enzymet till en HER2-bindande ADAPT. Denna tydliga fördel hos fusionsproteiner, samt att de kan produceras som funktionella enheter direkt i E. coli, innebär att det extra steget att konjugera eller koppla cytotoxiska substanser till affinitetsproteinet kan undvikas. Sammantaget påvisar resultaten att mindre proteindomäner, så som scaffoldproteiner, kan modifieras till att bli bifunktionella och är därför ett lovande framtida alternativ till nuvarande läkemedelsstrategier.