Characterization of Single Nanovesicles and Their Potential for Cancer Diagnostics

QC 2024-09-12

Abstract

Extracellulära vesiklar (EVs, ~30 nm - 5 µm) är lipiddubbelskiktsinneslutna partiklar som uttrycker värdefull biologisk information som proteiner, lipider och nukleinsyror som reflekterar deras föräldracell.Upptäckten av deras betydelse i cell-till-cellkommunikation utlöste en explosion inom forskning. Deras mängd, förmåga att fritt passera naturliga barriärer i kroppen och reflektion av dess ursprungliga cell gör dem till lämpliga aktörer inom områden som behandlingsövervakning och riktad läkemedelsleverans. Genom att undersöka hur EV-subpopulationer interagerar med celler kan vi också få ytterligare insikter i teoretiska frågor som hur celler kommunicerar och hur celler reagerar på yttre stimuli. Praktiskt taget alla celler i kroppen släpper ut EVs; varje cell kan innehålla flera ursprungsplatser för biogenes, och EVs kan ha olika avsedda syften som också återspeglas i deras sammansättning. Därför är EVs extremt heterogena i storlek, uttrycksnivå av biomolekyler och nanomekaniska egenskaper som elasticitet. Denna heterogenitet och den lilla storleken på vesikeln utgör tekniska utmaningar för de karaktäriseringsplattformar som finns idag. EVs kan studeras i bulk med ett enda resultat för en hel partikelensemble eller individuellt, vilket ger en karakterisering av individuella vesiklar i ett prov. Bulkmetoder är ofta snabbare, erbjuder högre genomströmning och kan ibland vara det enda alternativet för att analysera vissa delar, såsom RNA. Men för en fullständig karaktärisering måste vi hämta information om enstaka vesiklar. Denna avhandling utforskar tekniker för att karakterisera EVs på en enstaka vesikelnivå med tre olika plattformar: ett fluorescensmikroskop, ett atomkraftmikroskop och ett kombinerat fluorescens- och atomkraftmikroskop.

Först används ett fluorescensmikroskop för att studera EVs som frigörs av celler i en modellstudie av cancercellinjer. Cellerna lämnas antingen obehandlade eller behandlas med två läkemedel: ett som cellerna ska svara på och ett som de ska vara immuna mot. Fem relevanta ytproteiner taggades, fotograferades och analyserades.Studien avslöjade möjligheten att bevaka läkemedelssvar genom immunfluorescens. Därefter användes plattformen för att studera lungcancerpatienter som genomgick behandling med EVs hämtade genom flytande biopsi.Varje patient genererade två uppsättningar EVs: ett prov från före behandling och ett prov efter behandling, men innan tumören slutade svara på läkemedlet. Medan studien avslöjade förändringar i individuella proteiner när man jämförde de två proverna inom varje patient, var det svårt att särskilja ett mönster angående behandlingslängden före läkemedelsresistens. Det var inte förrän vi studerade korrelationen mellan proteiner och kombinerade alla proteinuttryck i ett prov till en gemensam sannolikhetsfördelning som trenderna blev tydligare. Längre behandlingar visade sig exempelvis ha en starkare positiv korrelation bland proteinerna. Detta understryker vikten av att inkludera sofistikerade statistiska metoder för att analysera kliniska EV-prover på en enda EV-nivå.

Därefter konstruerades en teoretisk modell som tar hänsyn till vesikelns flytande egenskaper. Modellen överensstämmer med kraftspektroskopimätningar utförda med kraftmikroskopi. Tre EV-prover med olika proteinnivåer jämfördes i termer av elasticitetsmoduler. Med den låga genomströmningen av EVs i plattformen utvecklades ett statistiskt ramverk för att jämföra fördelningarna av styvhetsvärden. Ramverket avslöjade en stor variation i styvhetsvärden extraherade från en enda vesikel, vilket hypotetiskt tillskrivs termiska fluktuationer och diffusion av membranmolekyler.

Slutligen kombinerade vi fluorescensmikroskopet och atomkraftmikroskopet för att undersöka subpopulationer och heterogenitet hos individuella EVs i både proteinuttryck och exakta mekaniska mätningar av storlek och Youngs modul. Plattformen avslöjade distinkta subpopulationer med unika egenskaper i de analyserade parametrarna. Dessa kombinerade mätningar är de första i sitt slag, och en kombinerad plattform som karakteriserar EVs på flera sätt kan ge fantastiska insikter om EV-biologi.

urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:kth:diva-352959