Till innehåll på sidan
Till KTH:s startsida

Fluorescence-based fluctuation techniques for molecular, cellular and tissue studies

Tid: Fr 2025-02-28 kl 09.00

Plats: FB53, Roslagstullsbacken 21, Stockholm

Språk: Engelska

Respondent: Niusha Bagheri , Bio-Opto-Nanofysik

Opponent: Prof. Jérôme Wenger,

Handledare: Prof. Jerker Widengren, ; Dr. Haichun Liu,

Exportera till kalender

QC 2024-01-31

Abstract

Inom fluorescensbaserad biologisk forskning används olika metoder för att förbättra signal/bakgrundsförhållandet (SBR). Ett allmänt tillvägagångssätt är att övergå till NIR-våglängder för excitation, där bakgrunden från cellulär autofluorescens (AF) är minimal. Användningen av NIR-fluoroforer ger flera ytterligare fördelar, bland annat högre penetrationsdjup och lägre fototoxicitet på grund av lägre fotonenergier. Den låga känsligheten hos standarddetektorer i NIR-området är dock en viktig faktor som hindrar en utbredd användning av NIR-fluoroforer. Det låga kvantutbytet och den kortare livslängden hos NIR-fluoroforer innebär ytterligare utmaningar. Vissa detektorer, t.ex. supraledande, med nanotrådsbaserade enfotondetektorer (SNSPD), är konstruerade för att fungera bättre i NIR-området. De är dock förknippade med betydande kostnader. I Paper II demonstrerades en möjlighet till tvåkanalsdetektering med en enda SNSPD för att ytterligare öka deras potential. Lock-in-förstärkning är en annan vanligt förekommande metod för att förbättra SBR. Lock-in-detektering förstärker dock även oavsiktligt laserljus från spridning eller reflektion eftersom det moduleras med samma referensfrekvens. Bidrag från spritt laserljus kan ge en betydande bakgrund vid vävnadsavbildning där emissionsfilter ofta inte enkelt kan undertrycka denna bakgrund. I Paper III utnyttjades de olinjära egenskaperna hos lantanid-dopade uppkonverteringsnanopartiklar (UCNPs) som frekvensblandare för att generera nya frekvenskomponenter, som sedan kunde filtreras fram genom en snabb Fourier-transformation av emissionssignalen. Dessutom kunde ytterligare lågfrekventa pulssignaler genereras genom modulerad excitation med mer än en basmoduleringsfrekvens. Dessa resultat öppnar för bakgrundsfri avbildning baserad på UCNPs och med hjälp av låghastighetsdetektorer, inkluderande även kameror. Även om de två ovannämnda studierna fokuserade på fördelarna med att excitera och detektera i NIR-spektralområdet och därmed ta bort AF, bör fördelarna med inmärkningsfria studier baserade på AF i sig inte förbises. Aminosyran tyrosin är en av de rikliga men svaga källorna till AF i människokroppen. Dess emissioner kan också innehålla värdefull information om den lokala miljön, särskilt via dess blinkande egenskaper som återspeglar dess fotofysiska tillståndsövergångar. Denna information har förblivit otillgänglig för etablerade metoder som fluorescens korrelationsspektroskopi (FCS). FCS analyserar fluktuationer i fluorescensintensitet från starkt fluorescerande molekyler i låga koncentrationer och kräver SMD-förhållanden (single-molecule detection), vilket gör FCS-studier av svaga tyrosininnehållande molekyler extremt svåra. Istället kan en teknik för att följa transienta tillstånd (TRAST) användas, vilken gör det möjligt att utforska dessa moleculers fotofysik och utvinna relaterad omgivningsinformation. TRAST, som inte kräver SMD-förhållanden, ger flexibiliteten att tillämpas på svagt emitterande prover där signaler med låg fluorescensintensitet kan kompenseras genom att öka deras koncentration. I Paper I demonstrerades TRAST-mätningar på tyrosin, vilka sedan tillämpades för att följa konformationstillståndet hos det tyrosininnehållande proteinet Calmodulin. Att utnyttja AF är särskilt värdefullt eftersom det erbjuder ett märkningsfritt alternativ, där man undviker störningar som kan uppstå till följd av fluoroformärkning. Märkning med externa fluoroforer kan dock också ge ytterligare information till fluktuationsbaserade metoder, som TRAST och FCS. I Paper IV möjliggjorde studier av co-enzymet Q10 på fluoresceinmärkta unilamellära vesiklar direkt observation av protonutbyteskinetik och av PCA-effekter (proton collecting antenna) av Q10 i vesikelmembranet. I det här fallet, även om Q10 i sig är svagt AF, observerades PCA-effekter bättre genom förändringar i protoneringsrelaxationen hos den pH-känsliga fluorescein-fluoroforen vid variation av Q10-koncentrationerna i vesikelmembranen.

urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:kth:diva-359402